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下水道里飞出救世主,PlyC 王者归来



撰文:Alexandra Roginski

随着人体对抗生素的耐药性不断上升科学家一直在研究新的疗法目前研究重点转向了一种可以摧毁危险细菌的专业病毒克星。

“飞碟”、“甜甜圈”和“吃豆人”——美国和澳大利亚研究团队的科学家们不断为 PlyC 添加新的喻体,他们用了六年多时间试图解密其外形与结构——如果要令 PlyC 成为抗生素的备选替代品,这将是相当关键的一步。

1925 年,人们在美国密尔沃基的下水道中发现了可以杀死链球菌的 PlyC ——一种从噬菌体中提取的蛋白,噬菌体是一种经过数百万年进化的杀菌病毒,具有很强的针对性。

细菌噬菌体通常简称为噬菌体,最早发现于二十世纪初,一经发现就引发了医生们研究其治疗功用的兴趣。它们曾在二战中被用来治疗战场感染。

但随着青霉素的发现,人们对具有高度专业性的噬菌体的热情迅速消退,因为青霉素能铲除多种细菌。直至今天,随着细菌的耐药性不断上升,人类重回抗生素诞生之前无药可医的威胁渐渐迫近,噬菌体便再次引起了人们的关注。

 

噬菌体之王

在所有已知的噬菌体蛋白中,PlyC,即“噬菌体溶解酶”堪称其中的王者,相比其它同类蛋白,PlyC 杀死链球菌菌株的速度至少快 100 倍,而链球菌菌株正是引发咽喉感染、心脏病、肺炎、中毒性休克综合症以及局部皮肤感染等人体疾病和部分动物疾病的元凶。

然而,要将任何这种天然抗菌物用于人类治疗,研究人员首先需要了解其外观——这项任务涉及大量结构层面的复杂研究。

“从理论上讲,它有成千上万种分子类型,分别针对不同细菌。”蒙纳士大学 Sheena McGowan 博士说,她是《美国国家科学院院刊》(PNAS)揭开 PlyC 结构的论文的主要作者。

McGowan 博士与其在蒙纳士大学的同事 James Whisstock 教授及 Ashley Buckle 副教授使用 X 射线晶体衍射分析法来确定这种分子的三维结构。团队的合作伙伴还包括来自美国马里兰大学的助理教授 Daniel Nelson 和洛克菲勒大学的教授 Vincent Fischetti,他们都对PlyC进行过长期研究。

McGowan 博士表示:“青霉素以及其它抗生素都是非常了不起的药物,但我们必须考虑新一代疗法。有了噬菌体,我们就相当于获得了一个天然武器库。我们的想法是,如果随着时间推移,细菌开始对其中一种噬菌体产生耐药性,我们在整个范围内还有其它许多选择。”

此外,由于细菌和病毒自有生命之初就开始搏斗,噬菌体已自然进化到可以克服细菌宿主的耐药性这一全新障碍。

研究小组发现,PlyC 的力量蕴藏在其复杂的结构中:它由九个不同的蛋白元件组成。其环形基座包括 8 个部位,可以锁定链球菌细胞壁的受体进行结合(已知的其它噬菌体仅有一个结合部位)。位于环顶部的两个“催化亚单位”相当于两颗弹头,负责侵入细胞表面,吞噬并最终消灭细菌的细胞壁。

“如果你敲除一个活性部位,该蛋白质的活性仅为正常活性的百分之一。但如果同时敲除两个活性部位,由于其活动的协同性,就会有 100% 的活性,”助理教授Nelson说道,“它在打击细菌方面活像一头怪兽。”

自 1999 年开始,他便作为洛克菲勒大学 Fischetti 教授实验室的博士后研究员从事分子研究工作,而正是 Fischetti 教授在 1968 年从 40 年前来自下水道的噬菌体中纯化出了 PlyC。

在洛克菲勒大学研究人员拍摄的一段视频中,他们比较了两支充满乳白色链球菌溶液的试管,以验证这种蛋白的效力。在一支试管中滴入一滴 PlyC 溶液。30 秒钟后,液体变得清澈。从微观层面来看,PlyC 与链球菌细胞结合,吞噬其细胞壁并使每个细胞彻底破裂。

助理教授 Nelson 表示:“我们有许多针对不同细菌的噬菌体——葡萄球菌肺炎链球菌、李斯特氏杆菌、杆状菌、梭菌。但这种 PlyC 酶的活性是其它种类的 100 至 1,000 倍。因此,如果我们可以找出为何 PlyC 活性如此之强的原因,就可以利用该知识让其它酶也能发挥相同作用。”

当 Nelson 作为博士后研究员加入洛克菲勒时,他与 Fischetti 教授很快就开始针对具体疗法展开讨论——使用含 PlyC 的局部咽喉喷剂还是锭剂。2001 年,他们在《PNAS》上发表了新的发现,在动物模型中使用 PlyC 药物数小时后,普通咽喉感染即已清除干净。

这种惊人疗效引发了轰动,但 PlyC 仍然未显真容。

 

诱发晶体

对于这种能够拯救生命的蛋白,分子生物学家采用了众多技术来解析其形态,X 射线晶体衍射分析法是其中最神奇的一种技术,也是蒙纳士大学擅长的领域。

在 2006 年的一次会议上,Nelson 与澳大利亚研究委员会(ARC)的联邦研究员蒙纳士大学教授 Whisstock进行了一番专业交流。

PlyC 很快就进入了蒙纳士大学 Whisstock 教授的实验室,Whisstock 教授把这一结构难题交给其团队的一名博士后研究员,即 McGowan 博士,现在她已是 ARC 未来研究员。

蛋白晶体学结合了 X 射线技术、计算机技术和促使蛋白质形成微小晶体的精密技术。

McGowan 博士表示:“它最初呈液态,你需要耐心诱发其成为晶体。我们希望晶体能从溶液中析出并成为固体物质,但在众多的晶体中,只需要其中一种。”

为获得最佳晶体,晶体学家将尝试数千种不同的化学混合物。蒙纳士大学现在拥有先进的结晶研究机构—— Grollo Ruzzene 蛋白结构基金会中心,该中心可利用机器人自动完成结晶过程。但在 2006 年,这些工作必须由 McGowan 博士亲手完成。

结出的晶体将被放入同步加速器,用 X 射线束照射每个单独的晶体。衍射的 X 射线图将由计算机进行处理,计算出蛋白的结构,随后制作成图像。

McGowan 博士表示,较低的 PlyC 环实际显像的是其本身,她说:“那是我制作出的第一幅晶体结构图,这些数据如此精准严密,我们甚至可以使用一个自动化程序来确定其结构。”经过几天的数字运算,蒙纳士研究团队获得了一幅中间带有圆孔的高分辨率飞碟形结构图。

 

碎片中的秘密

要得到包含 PlyC 的单个晶体并非易事,有时甚至会觉得这是不可能完成的任务。McGowan 博士解释说:“在两到三年内,我设定并测试了 1,500 种以上的晶体。”她认为支撑自己与 PlyC 不懈斗争的已经不是耐心,而是顽固(在此期间,她和 Nelson 分别接管了位于蒙纳士大学和马里兰大学的研究实验室)。

“那些晶体全都叠在一起,而你不可能就这么使用。获得这种特定数据集的唯一办法源自一次一些晶体掉在地上摔成了碎片,而我捡起的碎片最终成为唯一衍射出可用图像的东西。”

在很长一段时间里,碎片中的数据没有带来任何结果。2010 年,McGowan 博士在用新电脑程序作最后一次尝试时,看到显示屏上出现了一个伴着多层平面结构的螺旋状模糊影像,而这正是蛋白质的一种特有结构。

从这个十分模糊的数据集开始,McGowan 博士在接下来的 18 个月拼凑出了一张三维拼图,以寻找一个“切入角”。她利用多种计算机程序,手动构建了将近 10,000 种原子,以创造出更多的螺旋和平面影像。每前进一步,电脑都会从数学角度检验她构建的内容是否正确。如果不对,她就必须拆除分解,然后重新开始。

最后,身为澳大利亚国家健康与医学研究委员会高级研究员的 Buckle 副教授也加入该团队,利用其在化学和蛋白结构方面的丰富经验,帮助 McGowan 博士连接这些形状。

“我们面临着两个严峻挑战。首先,我们必须把数百个小型蛋白链‘片段’以一种有意义的方式拼凑出来,至少要构成某种看上去像是蛋白质的东西,”Buckle 副教授说。

“其次,我们必须将正确的氨基酸—— 20 种蛋白构件分子分配到正确的位置。在实际情况中,你必须同时解决这两个问题,即重新连接和重新排序,从而在这一过程中逐步改善模型。”

这种耗时而艰辛的努力最终获得了成功,晶体碎片的秘密终于大白天下:分子的功能尾(business end)是一种双重攻击武器。

PlyC 为何如此难以结晶,也许可以在 McGowan 博士与 Buckle 副教授的一个想法中找到答案——在开始吞噬细胞壁前,PlyC 弹头会改变结构形态。蒙纳士大学的研究人员希望基于这项研究,利用计算机仿真技术捕捉整个演变过程,提供一份记录噬菌体完成这项清除工作的实况录像。

当然,能有这种图像就已足够。

 

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噬菌体研究的下一阶段

 

PlyC 未来会作为治疗或预防药物用于人体和动物。

对儿童而言,由 A 组链球菌引起的喉咙痛只需使用 PlyC 喷剂、锭剂或漱口水,数小时后即可康复。它还可用于治疗皮肤局部感染引发的脓疱疹。

对于动物,PlyC 可以铲除引起奶牛乳房炎的链球菌菌株,解决乳品行业的这一巨大成本负担。而另一目标菌株则会导致马腺疫——顾名思义,它会致使马匹咽喉出现梗阻性淋巴结肿大。PlyC 可用于配制预防性动物饲料,或者对于马匹而言,用来擦拭马厩。

马里兰大学的 Daniel Nelson 助理教授预计,上述任何方面的开发项目都是浩大的工程,需要生物科技或制药企业的大力支持与协助。

他说:“不过,抗生素目前仍可有效对付链球菌。我们发现,对于金黄色葡萄球菌(大多数医院公认的超级细菌 MRSA)感染等许多其他疾病,噬菌体酶的活性并不高。未来的研究工作可能会尝试让这种酶对于其它种类的细菌也能保持相同的活性。我们可以尝试换出 PlyC 的环形结构,然后通过生物工程将其绑定到金黄色葡萄球菌的细胞壁上。”

由于新近发现的 PlyC 的复杂性,这项工作的进展比预期更为缓慢。但研究人员已经确定,另一种与 PlyC 非常类似的噬菌体可以置入引发蛀牙的一种变形链球菌。

助理教授 Nelson 解释说:“这涉及到漱口水、牙膏等局部治疗产品。这些将成为本实验室里重点关注的研究领域。”

噬菌体药物至少还需十年时间才能投入市场。

对于蒙纳士大学的 McGowan 博士而言,这意味着必须立即着手对噬菌体的基本特性开展研究,尽管诞生于 20 世纪的特效药目前仍能保护我们免受细菌侵害之虞。

她解释说:“尽管现在仍有抗生素的保护,但我们必须开始新的研究。因为可能要再过 10 到 30 年,噬菌体类药物才能问世,所以我们必须居安思危,以防出现治疗药物青黄不接的现象。”

蒙纳士社交媒体

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